Western Blotting(wB)的背景比較黑且條帶不清晰的原因可能有很多。以下是一些常見(jiàn)的可能原因:
1. 過(guò)度染色：如果樣品中的蛋白質(zhì)含量較高，可能會(huì)導(dǎo)致過(guò)度染色，使得背景變黑且條帶不清晰。建議優(yōu)化染色的時(shí)間和濃度，避免過(guò)度染色。
2. 組織破碎：如果組織破碎不完整，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)在膜上擴(kuò)散或形成模糊的條帶。建議在制備樣品時(shí)加入足夠的保護(hù)劑和蛋白酶抑制劑，避免蛋白質(zhì)的破壞和降解。
3. 次要抗體問(wèn)題：次要抗體可能存在污染或交叉反應(yīng)，導(dǎo)致背景比較黑。建議使用高質(zhì)量的次要抗體，確保其特異性和純度。
4. 蛋白質(zhì)不純：如果樣品中存在其他蛋白質(zhì)，可能會(huì)導(dǎo)致背景比較黑。建議使用高純度的蛋白質(zhì)樣品，避免其他蛋白質(zhì)的干擾。
5. 轉(zhuǎn)印問(wèn)題：如果轉(zhuǎn)印條件不合適，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的擴(kuò)散和條帶模糊。建議優(yōu)化轉(zhuǎn)印條件，確保蛋白質(zhì)可以均勻地轉(zhuǎn)移到膜上，并避免過(guò)度轉(zhuǎn)印。
綜上所述，要解決WB背景比較黑且條帶不清晰的問(wèn)題，需要仔細(xì)檢查每個(gè)步驟，并根據(jù)具體情況進(jìn)行優(yōu)化。

考慮以下幾點(diǎn)原因:
1.膜污染
2.曝光時(shí)膜上發(fā)光液不足
3.封閉時(shí)間不夠
4.封閉液不合適
5.TBST被污染
6.洗滌不徹底
7.抗體濃度可能過(guò)高
8.抗體和封閉劑之間的交叉反應(yīng)
建議按以下幾點(diǎn)處理:
1.使用干凈的鑷子并戴上手套操作，以防止膜污染。
2.使膜充分浸在發(fā)光液中
3.增加封閉孵育時(shí)間
4.換其他封閉液(5%脫脂奶粉、5%BSA)
5.使用新的TBST
6.增加洗滌時(shí)間和洗滌緩沖液的體積
7.降低一抗或二抗的濃度
8.用TBST配制抗體和封閉液，吐溫可以減少交叉反應(yīng)。